อาหารชักนำการเกิดต้น

    อาหารพื้นฐานที่ใช้ชักนำการเกิดต้นของชิ้นส่วนตั้งต้น ทั้งส่วนยอด หน่ออ่อน และใบอ่อน จะใช้สูตรเดียวกัน คือ อาหารสูตร MS (1962) ดัดแปลง แต่จะแตกต่างกันที่สารควบคุมการเจริญเติบโต เนื่องจากวัตถุประสงค์ของการเลี้ยงที่ไม่เหมือนกัน คือ ส่วนยอดและหน่ออ่อนจะเกิดต้นโดยตรง ในขณะที่ใบอ่อนเกิดแคลลัส แล้วจึงกระตุ้นให้เกิดต้นภายหลัง โดยอาหารเพาะเลี้ยงสูตร MS (1962) ดัดแปลงนี้มีความเข้มข้นของธาตุอาหารหลักครึ่งหนึ่งของสูตรอาหาร (1/2MS) ยกเว้น NH4NO3 ที่ใช้เพียง 200 มิลลิกรัมต่อลิตร ส่วนธาตุอาหารรองใช้เต็มสูตร และประกอบด้วย Thiamine.HCl 0.4 มิลลิกรัมต่อลิตร NaFeEDTA 25 มิลลิกรัมต่อลิตร Myo-inositol 100 มิลลิกรัมต่อลิตร  Adenine sulfate 20 มิลลิกรัมต่อลิตร ถ้าหากเพาะเลี้ยงยอดหรือหน่ออ่อนให้เติมสารควบคุมการเจริญเติบโต คือ TDZ 1 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ IBA 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร แต่ถ้าเพาะเลี้ยงใบอ่อนให้เติม 2,4-D 2 มิลลิกรัมต่อลิตร หรือ BA 1 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ 2,4-D 0.1-0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร จากนั้นเติมน้ำตาลซูโครส 20 กรัมต่อลิตร และวุ้น 8 กรัมต่อลิตร ปรับค่าความเป็นกรดเป็นด่างเท่ากับ 5.8 นำอาหารไปนึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส หรือที่ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลานาน 15 นาที

สภาพการเพาะเลี้ยง

    นำขวดอาหารเพาะเลี้ยงที่มีชิ้นส่วนยอดและข้อไปวางไว้ในห้องที่มีการควบคุมอุณหภูมิ 25+2 องศาเซลเซียส ความเข้มแสง 40 ไมโครโมลต่อตารางเมตรต่อวินาที ด้วยหลอดฟลูออเรสเซนส์ เป็นเวลา 16 ชั่วโมงต่อวัน ส่วนขวดเพาะเลี้ยงที่มีชิ้นส่วนใบอ่อน ให้นำไปไว้ในที่มืดเป็นเวลานาน 4-6 สัปดาห์ จะเกิดแคลลัสบวมพองขึ้นบริเวณรอยตัดของเนื้อเยื่อและเส้นใบ จากนั้นให้ย้ายแคลลัสไปเลี้ยงบนอาหารการเพิ่มปริมาณต้น สูตร MS (1962) เพื่อชักนำการเกิดต้น ซึ่งในระยะนี้ให้นำขวดเพาะเลี้ยงไปวางไว้ในสภาพแวดล้อมเช่นเดียวกับการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนยอดและข้อ ทำการเลี้ยงนานประมาณ 4-8 สัปดาห์ แคลลัสจะพัฒนาไปเป็นต้นอ่อนจำนวนมาก จากนั้นจึงตัดย้ายเพื่อเพิ่มปริมาณต้นต่อไป

2.การเพิ่มปริมาณต้น

    นำต้นอ่อนที่ได้จากการกระตุ้นให้เกิดต้นมาตัดย้ายเพื่อทำการเพิ่มปริมาณต้น โดยการตัดแยกยอดและข้อไปเพาะเลี้ยงบนอาหาร  ซึ่งการขยายพันธุ์หน้าวัวโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโดยทั่วไป เป็นการเพาะเลี้ยงต้นให้เกิดจากตาข้าง (axillary shoot culture)
    การเพาะเลี้ยงตาข้าง เป็นการเพาะเลี้ยงโดยอาศัยวิธีการและสูตรอาหารที่กระตุ้นการเจริญของตาข้าง  ซึ่งเป็นเทคนิคสำหรับการผลิตต้นจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ การเพิ่มจำนวนต้นทำได้โดยนำตาข้างจากต้นที่เกิดขึ้นใหม่มาทำการเพาะเลี้ยงและทำซ้ำไปเรื่อยๆ เพื่อเพิ่มจำนวน โดยนำส่วนตาข้างมาเลี้ยงในอาหารสูตร MS (1962) ที่ประกอบด้วย Thiamine.HCl 1 มิลลิกรัมต่อลิตร Nicotinic acid 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร Pyridoxine.HCl  0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร NaFeEDTA 35 มิลลิกรัมต่อลิตร Myo-inositol 100 มิลลิกรัมต่อลิตร น้ำตาลซูโครส 30 กรัมต่อลิตร วุ้น 8 กรัมต่อลิตร และเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต KIN 2.5 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ IAA 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร ปรับค่าความเป็นกรดเป็นด่างเท่ากับ 5.8
    การเพิ่มปริมาณต้นหน้าวัวนอกจากเพาะเลี้ยงบนอาหารแข็งแล้ว ยังสามารถเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวได้ด้วยเช่นกัน ซึ่งภาชนะในการเพาะเลี้ยงนั้นใช้ได้ทั้งในขวดขนาด 4 หรือ 8 ออนซ์ หรือขวดชมพู่ ขนาด 125 หรือ 250 ลูกบาศก์เซนติเมตร ซึ่งหากใช้ภาชนะขนาดใหญ่ต้องระมัดระวังการปนเปื้อนที่อาจจะเกิดขึ้นได้ในระหว่างการปฏิบัติงาน ดังนั้นหากยังไม่ชำนาญมีข้อแนะนำว่าควรเริ่มจากภาชนะขนาดเล็กก่อน การเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวสามารถวางขวดเพาะเลี้ยงบนเครื่องเขย่าหรือวางนิ่งบนชั้นวางขวดเลี้ยงต้นไม้ก็ได้ โดยมีข้อแม้ว่าขวดเพาะเลี้ยงที่วางบนชั้นวางขวดเลี้ยงต้นไม้นั้น ต้นจากตาข้างที่ทำการเพาะเลี้ยงจะต้องมีขนาดความสูงมากกว่าอาหารเหลวในขวด และมีจำนวนต้นมากพอที่จะพยุงต้นไม่ให้จมลงในอาหารเหลว ซึ่งการเพิ่มปริมาณต้นโดยใช้อาหารเหลวนี้ ต้นจะสามารถเจริญเติบโตและเพิ่มจำนวนได้มากกว่าอาหารแข็ง (ภาพที่ 5) จากนั้นจึงทำการย้ายเนื้อเยื่อทุกๆ 6 สัปดาห์

ภาพที่ 5  การเพิ่มปริมาณต้นหน้าวัวในสภาพปลอดเชื้อ      (a)  เลี้ยงบนอาหารแข็ง      (b)  เลี้ยงในอาหารเหลว

ที่มา:  ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สำนักวิจัยและส่งเสริมวิชาการการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้

3. การออกราก
        เมื่อทำการเพิ่มปริมาณต้นหน้าวัวได้จำนวนมากแล้ว จึงตัดส่วนยอดที่มีขนาดความสูง 4-5 เซนติเมตร ไปเลี้ยงในอาหารกระตุ้นการเกิดราก ซึ่งเป็นอาหารสูตร MS (1962)  ดัดแปลงสูตรเดียวกับระยะเพิ่มปริมาณต้น แต่ไม่มีการเติม KIN จะเติมเฉพาะกลุ่มออกซินที่ใช้ในการเร่งรากเท่านั้น โดยใช้ IAA ความเข้มข้น 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร และสภาพอาหารที่ใช้เป็นอาหารเหลว โดยบรรจุอาหารเหลว ปริมาตร 20 มิลลิลิตร ในขวดขนาด 4 ออนซ์ หรือขนาด 120 ลูกบาศก์เซนติเมตร แล้วใส่ชิ้นส่วนยอดจำนวน 10 ชิ้นส่วน นำขวดเพาะเลี้ยงไปวางบนเครื่องเขย่าหรือวางบนชั้นเลี้ยงต้นไม้ ได้เช่นเดียวกับระยะการเพิ่มปริมาณต้นในอาหารเหลว หลังจากเลี้ยงนาน 1 เดือน ต้นจะยืดยาวขึ้นและแทงรากออกมา จึงย้ายต้นออกปลูกจากขวดต่อไป (ภาพที่ 6)

ภาพที่ 6 การชักนำการออกรากของต้นหน้าวัว จำนวน 10 ต้นต่อขวด  ที่เพาะเลี้ยงในอาหารเหลวนาน 4 สัปดาห์

ที่มา:  ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สำนักวิจัยและส่งเสริมวิชาการการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้